WP8 : Techniques de transgenèse et cellules ES


Objectifs

Conserver un haut niveau de technicité dans nos coeurs de métier : transgenèse, cellules souches, recombinaison homologue.

Exemple de sujets :

  • Manipuler le génome par de nouvelles approches technologiques (Tale Nuclease; ZFN; autres méthodes)
  • Micro-injection des ADN ou ARN Tale Nuclease; ZFN dans l'embryon
  • Electroporation ADN ou ARN Tale Nuclease; ZFN dans les ES
  • Analyser et proposer des conditions de culture de cellules ES
  • Caractériser et contrôler l'état de pluripotence de cellules ES (Marqueurs)
  • Etudier les méthodes de micro-injection et d'optimisation de la capacité de colonisation de cellules ES modifiées (différents types d'embryons hôtes disponibles; laser; agrégation, autres).
  • Etablir de nouvelles lignées de cellules ES
  • Aider et conseiller à l'utilisation des ES issues de consortiums internationaux
  • Analyser les nouveaux outils ou nouvelles techniques dans le domaine

L'action du WP8 sera de traiter les aspects technologiques en aval des thèmes abordés en WP10. Certains centres d'intérêts communs aux WP8 et WP10 feront l'objet de réunions transversales entre ces deux groupes de travail.

Bilan des actions passées

Les représentants de 17 centres de transgenèse se sont réunis pour échanger au cours de 3 réunions de travail par an incluant parfois des séminaires ou journal club présentés par l’un des membres du groupe de travail ou par un invité extérieur. Les thèmes suivants ont ainsi été discutés et approfondis :

  • Nouvelles technologies de transgénèse présentées lors du congrès de la Société Internationale de Transgenèse (ISTT)
  • ICSI chez la souris (Francina Langa - IPP)
  • Transgenèse lentivirale chez la souris (Francina Langa + Denise Aubert- PBES)
  • Transgenèse et KO chez le rat (Séverine Menoret-IFR37)
  • Culture et dérivation de lignées de cellules ES en milieu 2i (participation de représentants du WP8 au séminaire du Dr Austin SMITH – et invitation du Dr Philippe CLERC Institut Pasteur Paris)
  • Analyse technique du blastokit (société CRL)

Les échanges se sont largement poursuivis entre les centres, grâce à la liste de diffusion, sur les techniques et problématiques de transgenèse : disponibilité et conditions de culture d’ES de fonds C57BL/6, dérive des ES, protocole de différenciation, contrôle qualité des ES avant injection, réimplantation/choix des porteuses/problème du cannibalisme.

Ces échanges ont abouti à la réalisation de stages tutorés qui ont permis à certains centres d’acquérir la technologie de dérivation de lignées de cellules ES (ICS), injection BAC (IPP), transgénèse lentivirale (PBES).

En parallèle de ces échanges, le groupe de travail a produit un certain nombre de travaux, et études. Ainsi, une plaquette a été produite reprenant les activités et les spécificités de chacun des centres de transgénèse.
Trois études techniques ont été réalisées par un ou plusieurs centres sur :

  • le choix de marqueurs de suivi du stade de différenciation des ES murines (CIML)
  • l’utilisation de l’assistance laser pour l’injection de cellules ES (CIML – Cochin - Université de Limoges)
  • l’utilisation d’embryons congelés pour la micro-injection (CIML, ICS, Cochin, PBES, IPBS, Université de Limoges)

Enfin, un appel d’offre Inserm a été réalisé pour l’achat de réactifs de culture ES au titre du réseau. Cet appel d'offre permet ainsi à tous les centres partenaires du réseau de bénéficier du prix de l'appel d'offre quel que soit le volume de consommation du réactif inscrit à l'appel d'offre. Cette démarche collective nous a permis de bénéficier d'au moins 50% de remise sur le prix catalogue de certains réactifs.

Actions futures

L’ensemble des membres du WP8 souhaite poursuivre ces échanges et collaborations, avec pour feuille de route :

  • la réalisation de nouveaux appels d’offre pour les réactifs ES ou embryons
  • la participation de représentants du WP8 aux rencontres internationales du domaine : ISTT, congrès de Leiden, congrès de Nantes
  • la formalisation de la veille bibliographique en maintenant la présentation régulière de « journal club » et l'invitation d’experts ou participation à des séminaires dans le domaine.

Le WP8 souhaite engager également au minimum une réunion transversale avec d'autres WP du réseau sur un ODJ commun. Ces réunions permettront de partager encore plus fortement l'expertise croisée de chacun de ces WP dans la genèse de souris génétiquement modifiées. Ainsi nous pourrons approcher de manière encore plus intégrée tous les aspects que cela implique :

  • conservation des statuts sanitaires,
  • éviter les risques de trans-contamination de l'animal via les cellules ES mutées,
  • les règlements adossés à la modification des génomes par des systèmes viraux,
  • apporter à toutes nos animaleries des aspects zootechniques les plus adaptés à la réussite des projets d'invalidation génique (diminution du cannibalisme, enrichissement des cagées, acoustique des zones d'élevage etc...)

Coordination

Fabien Danjan
CIPHE, Marseille

Rémi Pierre
Institut Cochin, Paris